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凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24) 分子生物試劑

  • 更新時(shí)間:  2023-07-27
  • 產(chǎn)品型號(hào):  150343
  • 簡(jiǎn)單描述
  • 凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24)
    應(yīng)用 儀器
    全基因組測(cè)序二代測(cè)序平臺(tái)?
    外顯子組測(cè)序
    SNP基因分型芯片芯片平臺(tái)?
    Array CGH
    qPCR/PCR技術(shù)Real-time PCR/PCR儀?
    Sanger測(cè)序毛細(xì)管測(cè)序儀?
    焦磷酸測(cè)序PyroMark (QIAGEN)
詳細(xì)介紹

凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24)

Performance


覆蓋基因組所有位點(diǎn),十分適用于二代測(cè)序和其他下游應(yīng)用

REPLI-g Single Cell Kit擴(kuò)增的DNA平均長(zhǎng)度大于10 kb,并且覆蓋所有基因組位點(diǎn)。該產(chǎn)品已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,適用于二代測(cè)序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交(aCGH)和real-time PCR應(yīng)用等多種下游分析。使用該產(chǎn)品無(wú)需單獨(dú)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,減少了手動(dòng)操作,獲得的產(chǎn)物長(zhǎng)度PCR方法更長(zhǎng)(參見"Next-generation sequencing using REPLI-g amplified DNA requires less hands-on time and generates more sequence information than PCR-based methods")。用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二代測(cè)序,獲得高品質(zhì)結(jié)果。這表明該試劑盒的位點(diǎn)覆蓋率大,錯(cuò)配率低,其擴(kuò)增的DNA(甚至從單一細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增的DNA)能夠與純化獲得的基因組DNA相媲美(參見"Comparable NGS results")。另有研究對(duì)人類常染色體和X染色體上的多個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行了分析,三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)均顯示:基因組的所有位點(diǎn)被成功擴(kuò)增,沒有遺漏任何一個(gè)位點(diǎn)(參見"Complete genome coverage")。

REPLI-g Single Cell Kit的表現(xiàn)優(yōu)于其他供應(yīng)商的試劑盒

其他供應(yīng)商的試劑盒基于PCR技術(shù)進(jìn)行全基因組擴(kuò)增,獲得的產(chǎn)物片段較短,帶有PCR引物序列,可能影響下游應(yīng)用。基于PCR的全基因組擴(kuò)增容易出現(xiàn)錯(cuò)誤,會(huì)導(dǎo)致堿基對(duì)突變、STR的減少或增多,使用低保真Taq DNA聚合酶會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)缺失。相反,REPLI-g Single Cell Kit能夠進(jìn)行高度均一的全基因組擴(kuò)增,位點(diǎn)偏差小。對(duì)四個(gè)試劑盒進(jìn)行了檢測(cè),其中兩個(gè)利用多重置換擴(kuò)增技術(shù)(包括REPLI-g Single Cell Kit),另外兩個(gè)利用PCR技術(shù)。采用單一細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)方案對(duì)所有試劑盒進(jìn)行序列位點(diǎn)檢測(cè)。除REPLI-g Single Cell Kit外的其他供應(yīng)商的試劑盒都出現(xiàn)了位點(diǎn)的遺漏(參見"Unbiased DNA amplification from a single cell")。


凱杰試劑盒REPLI-g Single Cell Kit (24)

Principle


REPLI-g Single Cell Kit含有REPLI-g sc Polymerase,這是一種優(yōu)化的新型高保真Phi 29聚合酶。該試劑盒采用多重置換擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增復(fù)雜的基因組DNA,溫和的堿孵育能夠避免DNA片段化,促進(jìn)對(duì)所有位點(diǎn)的無(wú)偏差擴(kuò)增。該試劑盒十分適用于分離的腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞等單一細(xì)胞,能夠擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA(參見表1)。此外,該試劑盒還配有專用于鮮血或干血、新鮮或冷凍組織的實(shí)驗(yàn)方案,可用于多種研究樣本。常規(guī)DNA產(chǎn)量可達(dá)40 µg,對(duì)模板的起始量要求低,因此進(jìn)行后續(xù)遺傳分析時(shí)無(wú)需檢測(cè)DNA濃度。REPLI-g Single Cell Kit的擴(kuò)增產(chǎn)物平均長(zhǎng)度超過(guò)10 kb,且覆蓋所有位點(diǎn),適合于多種應(yīng)用,包括二代測(cè)序、基于芯片技術(shù)的比較基因組雜交、焦磷酸測(cè)序和real-time PCR分析(參見表2)。

表2. 下游應(yīng)用和儀器
應(yīng)用儀器
全基因組測(cè)序二代測(cè)序平臺(tái)?
外顯子組測(cè)序
SNP基因分型芯片芯片平臺(tái)?
Array CGH
qPCR/PCR技術(shù)Real-time PCR/PCR儀?
Sanger測(cè)序毛細(xì)管測(cè)序儀?
焦磷酸測(cè)序PyroMark (QIAGEN)
? 多家供應(yīng)商均有銷售

擴(kuò)增原理

REPLI-g Single Cell Kit采用等溫基因組擴(kuò)增技術(shù),即多重置換擴(kuò)增(MDA)。六聚體與變性DNA隨機(jī)結(jié)合,然后在等溫條件下,在優(yōu)化的Phi 29聚合酶作用下,發(fā)生鏈置換合成反應(yīng)。每個(gè)置換后的單鏈作為模板,與引物結(jié)合,可擴(kuò)增獲得高產(chǎn)量DNA(參見"Multiple Displacement Amplification (MDA) technology")。Phi 29聚合酶為噬菌體衍生酶,具有3'→5'引物外切酶活性(校正活性),其保真性是Taq DNA聚合酶的1000倍。Phi 29聚合酶在優(yōu)化的REPLI-g Single Cell緩沖液體系中,能夠輕松的打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu),因此可促進(jìn)擴(kuò)增時(shí)聚合酶正常工作。可擴(kuò)增獲得長(zhǎng)達(dá)100 kb的DNA片段(參見"Unbiased amplification with Phi 29 polymerase")。

細(xì)胞裂解和DNA的堿變性 

基因組DNA在用于酶促擴(kuò)增反應(yīng)前必須經(jīng)過(guò)變性,而這一變性過(guò)程通常使用高溫或高pH值(強(qiáng)堿)孵育。REPLI-g Single Cell Kit采用溫和的堿孵育,在細(xì)胞裂解、DNA變性的同時(shí),確保DNA片段化程度小,不產(chǎn)生堿基突變。因此擴(kuò)增獲得的DNA完整度高,產(chǎn)物長(zhǎng)度長(zhǎng),覆蓋位點(diǎn)多(參見"Effect of heat and alkaline denaturation on loci representation")。

高效去除可檢測(cè)到的DNA污染

REPLI-g Single Cell Kit中的所有組分都經(jīng)過(guò)了dute的去污染流程,避免擴(kuò)增產(chǎn)物被污染。在標(biāo)準(zhǔn)化流程中,對(duì)緩沖液和試劑進(jìn)行紫外線照射,確保其不會(huì)污染DNA(參見"Innovative decontamination procedure")。紫外線照射后,對(duì)試劑盒的所有組分進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制,確保其性能。

Procedure


簡(jiǎn)單的單管操作

REPLI-g Single Cell Kit可對(duì)單一細(xì)胞或有限的樣本進(jìn)行簡(jiǎn)便、可靠、準(zhǔn)確的全基因組擴(kuò)增。反應(yīng)體系構(gòu)建十分便利、可靠,僅需15分鐘左右的手動(dòng)操作(參見"REPLI-g Single Cell Kit procedure")。專用的緩沖液和試劑可對(duì)單一細(xì)胞、有限的組織材料、或純化的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)量高、位點(diǎn)覆蓋率大(參見表3)。REPLI-g技術(shù)擴(kuò)增獲得的DNA可在–20°C長(zhǎng)期儲(chǔ)存(參見"Consistent long-term stability")。請(qǐng)參見表4,了解REPLI-g產(chǎn)品線的更多信息。

表3. REPLI-g Single Cell Kit的成分
試劑盒成分優(yōu)勢(shì)
REPLI-g sc Polymerase最長(zhǎng)可達(dá)70 kb的長(zhǎng)片段
保真性是Taq聚合酶的1000倍
覆蓋所有位點(diǎn)
均一擴(kuò)增所有位點(diǎn)
REPLI-g sc Reaction Buffer?對(duì)所有位點(diǎn)進(jìn)行無(wú)偏差的擴(kuò)增
Buffer DLB (裂解和變性)高效擴(kuò)增
不損傷DNA
紫外線照射去除污染減少可檢測(cè)到的殘留DNA污染
? 含有鹽、引物和dNTP
表 4. 多種REPLI-g Kits的規(guī)格

REPLI-g Single CellREPLI-g MiniREPLI-g UltraFast MiniREPLI-g MidiREPLI-g ScreeningREPLI-g FFPEREPLI-g Mitochondrial DNA
起始材料單一細(xì)胞、gDNA純化的基因組DNA、血液、細(xì)胞純化的基因組DNA、血液、細(xì)胞FFPE組織、FFPE組織中純化的基因組DNA純化的基因組DNA
另外提供其他起始材料的實(shí)驗(yàn)方案
起始量單一細(xì)胞、2–1000各細(xì)胞、組織、純化的gDNA (1–10 ng)>10 ng gDNA、0.5 µl血液或細(xì)胞(>600個(gè)細(xì)胞/µl)>10 ng gDNA、0.5 µl血液或細(xì)胞(>600個(gè)細(xì)胞/µl)組織切片(直徑1 cm,厚度10–40 µm);>100 ng gDNA>1 ng純化的gDNA
產(chǎn)量(µg/反應(yīng))40107–10408標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)量:≤10; 高產(chǎn)量:≤403–5
反應(yīng)時(shí)間8–16小時(shí)10–16 小時(shí)1.5小時(shí)8–16小時(shí)12–16小時(shí)標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)量:4小時(shí);高產(chǎn)量:10小時(shí)8小時(shí)
手動(dòng)操作時(shí)間15分鐘15分鐘15分鐘15分鐘15分鐘40分鐘15分鐘
規(guī)格反應(yīng)管反應(yīng)管反應(yīng)管反應(yīng)管孔板

Applications


使用REPLI-g Single Cell Kit擴(kuò)增獲得的DNA可用于多種下游應(yīng)用,包括:
  • 二代測(cè)序

  • 采用TaqMan引物/探針對(duì)進(jìn)行的SNP基因分型

  • 基于qPCR和PCR的突變檢測(cè)

  • STR/微衛(wèi)星分析

  • Sanger測(cè)序

  • 焦磷酸測(cè)序

  • aCGH等芯片技術(shù)





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